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技術(shù)文章
JD-ZWSJ非洲豬瘟快速診斷試劑盒非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測(cè)試劑盒???? ?? ??? ???? ?? PCR ?? ?? ??JD-ZWSJ非洲豬瘟快速診斷試劑盒非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測(cè)試劑盒：
【獸藥名稱】
通用名稱：非洲豬瘟病毒熒光PCR快速檢測(cè)試劑盒
商品名稱：無(wú)
漢語(yǔ)拼音：Feizhouzhuwenbingdu Yingguang PCR Kuaisu Jiance Shijihe
英文名稱：Real-time PCR for Rapid Detection of African Swine Fever Virus
【主要成分與含量】
序號(hào) | 成分 | 含量 |
1 | PCR反應(yīng)液 | 1管（1ml/管） |
2 | Solution A | 1管（5.5ml/管） |
3 | Solution B | 1管（5.5ml/管） |
4 | 陰性對(duì)照 | 1管（0.5ml/管） |
5 | 陽(yáng)性對(duì)照 | 1管（0.25ml/管） |
6 | 說(shuō)明書(shū) | 1份 |
【作用與用途】本試劑盒適用于豬血液、豬肉組織、淋巴結(jié)樣本中非洲豬瘟病毒核酸的檢測(cè)。
【用法與判定】
1 用法
1.1 樣品處理及模板準(zhǔn)備
1.1.1 樣品處理
·組織樣品處理：分別從豬肉組織、淋巴結(jié)不同位置取樣，用手術(shù)剪剪碎混勻后取0.1g于研磨器中研磨，加入1.5ml生理鹽水繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至1.5ml無(wú)菌離心管，12000 r/min離心2分鐘，取上清200μl備用。
·血液樣品無(wú)需處理，取200μl備用。
1.1.2 模板準(zhǔn)備
·根據(jù)不同的樣本類(lèi)型，按照下表準(zhǔn)備相應(yīng)的樣本用量。
·將樣本加入到1.5 ml離心管中，加入下表推薦體積的Solution A，渦旋震蕩20 s，并按照下表推薦的處理方法，室溫靜置3-5 min，或95℃金屬浴振蕩孵育3-5 min。
·樣本充分裂解后（95℃金屬浴振蕩孵育的樣本需恢復(fù)室溫），加入下表推薦體積的Solution B，并渦旋震蕩30 s，12000rpm離心2min，上清即為模板DNA。
·處理后的樣本如在2小時(shí)內(nèi)進(jìn)行下一步試驗(yàn)，請(qǐng)于4℃保存，如不能立即進(jìn)行下一步試驗(yàn)，請(qǐng)于-20℃保存。
樣本類(lèi)型 | 樣本用量 | Solution A | 處理溫度及時(shí)間 | Solution B |
全血 | 10 μl | 100 μl | 室溫靜置3-5min | 100 μl |
唾液 | 100ul | 100ul | 室溫靜置3-5min | 100 μl |
口腔拭子 | 1個(gè) | 400 μl | 95℃，3-5min | 400 μl |
組織勻漿 | 10 μl | 100 μl | 室溫靜置3-5min | 100 μl |
備注：組織樣本加入10倍體積的生理鹽水制成組織勻漿液后，可按照血液樣本的處理方法進(jìn)行處理。
1.1.3可利用商品化試劑盒提取核酸進(jìn)行反應(yīng)，效果更佳
1.2 熒光PCR擴(kuò)增
1.2.1 試劑準(zhǔn)備
實(shí)驗(yàn)前20分鐘將試劑從冰箱取出并恢復(fù)至室溫，使其*融化，充分混勻后瞬時(shí)離心去除管壁吸附液體。
1.2.2 配制反應(yīng)體系
按下表1體系，在配套PCR管中配制反應(yīng)體系，蓋緊管蓋后瞬時(shí)離心10秒，轉(zhuǎn)移至擴(kuò)增區(qū)。
表1 PCR反應(yīng)體系
成分 | 體積 |
PCR反應(yīng)液 | 18μl |
預(yù)準(zhǔn)備的模板（樣本/對(duì)照） | 2μl |
總體積 | 20μl |
1.2.3 PCR擴(kuò)增
快速模式
表2 儀器PCR擴(kuò)增參數(shù)
階段 | 溫度 | 時(shí)間 | 循環(huán)數(shù) |
1 | 95℃ | 30s | 1 |
2 | 95℃ | 10 s | 40 |
60℃ | 20 s（采集熒光信號(hào)） | ||
FAM通道采集熒光信號(hào)，需要內(nèi)參的話請(qǐng)同時(shí)打開(kāi)HEX/VIC熒光通道 | |||
2 判定
2.1 合理調(diào)整閾值線，不同儀器可根據(jù)儀器噪音情況進(jìn)行調(diào)整。
2.2 試劑盒有效性判定
·陰性對(duì)照：無(wú)Ct值，線形為直線或微斜，無(wú)明顯指數(shù)增長(zhǎng)。
·陽(yáng)性對(duì)照：Ct值≤30，有明顯指數(shù)增長(zhǎng)，呈典型的S型曲線。
2.3 樣本結(jié)果判定
·樣本檢測(cè)結(jié)果Ct值≤38，有明顯指數(shù)增長(zhǎng)，判定為陽(yáng)性，表明樣本中檢測(cè)出非洲豬瘟病毒。
·樣本檢測(cè)結(jié)果38＜Ct≤40，判定為可疑。應(yīng)對(duì)樣本進(jìn)行復(fù)測(cè)，若復(fù)測(cè)結(jié)果Ct值仍在38~40之間，有明顯指數(shù)增長(zhǎng)，則判定為陽(yáng)性，否則為陰性。
·樣本檢測(cè)結(jié)果無(wú)Ct值，判定為陰性，表明樣本中未檢測(cè)出非洲豬瘟病毒。
【注意事項(xiàng)】
（1）實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)仔細(xì)閱讀本試劑盒說(shuō)明書(shū)，嚴(yán)格按步驟執(zhí)行，不使用本試劑盒提供的組份或不按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)可能導(dǎo)致錯(cuò)誤結(jié)果。
（2）所有試劑應(yīng)在規(guī)定溫度儲(chǔ)存。-20℃保存的試劑在使用前應(yīng)充分混勻。試劑盒反復(fù)凍融次數(shù)不宜超過(guò)5次。
（3）實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)按照國(guó)家有關(guān)臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范執(zhí)行，實(shí)驗(yàn)過(guò)程應(yīng)分區(qū)（試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本制備區(qū)、核酸擴(kuò)增區(qū)），各區(qū)物品為，不得交叉使用，避免污染。
（4）操作臺(tái)、移液器、離心機(jī)等儀器用品應(yīng)經(jīng)常用1%次氯酸鈉、75%乙醇或紫外燈進(jìn)行消毒。耗材應(yīng)進(jìn)行無(wú)酶處理。
（5）待檢樣本、試劑盒組份及實(shí)驗(yàn)中的廢棄物需按照具有潛在傳染性物質(zhì)處理方法進(jìn)行處理。
（6）為防止熒光干擾，應(yīng)避免使用含熒光物質(zhì)的手套，避免用手直接接觸，預(yù)防交叉污染。
（7）檢測(cè)結(jié)果為陰性，并不*代表為非感染狀態(tài)，具體診斷需結(jié)合獸醫(yī)臨床。
（8）產(chǎn)生假陰性的可能原因?yàn)椋捍龣z樣本在采集、運(yùn)輸、保存及核酸提取過(guò)程中操作不當(dāng)造成DNA降解；樣本中核酸濃度低于z低檢測(cè)限；病毒待測(cè)靶基因出現(xiàn)變異；未經(jīng)驗(yàn)證的其他干擾因素。
（9）產(chǎn)生假陽(yáng)性的可能原因?yàn)椋捍龣z樣本采集、運(yùn)輸及核酸提取過(guò)程中發(fā)生交叉污染。
【規(guī)格】 50反應(yīng)/盒
【貯藏及有效期】 試劑盒-20℃以下冷凍避光保存，有效期為12個(gè)月。
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